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Aug 19, 2023

Virus

Scientific Reports volume 13, numero articolo: 4101 (2023) Cita questo articolo 1081 Accessi 1 Dettagli sulle metriche alternative L'espressione e la purificazione della miosina sono importanti per approfondimenti meccanicistici

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 4101 (2023) Citare questo articolo

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L'espressione e la purificazione della miosina sono importanti per le intuizioni meccanicistiche sulla funzione normale e sui cambiamenti indotti dalla mutazione. Quest'ultimo è particolarmente importante per la miosina II del muscolo striato, dove le mutazioni causano diverse malattie debilitanti. Tuttavia, la catena pesante di questa miosina è difficile da esprimere e il protocollo standard, che utilizza cellule C2C12, si basa sull'infezione virale. Questo richiede tempo e lavoro ed è associato a richieste infrastrutturali e rischi biologici, limitando l’uso diffuso e ostacolando la rapida generazione di un’ampia gamma di mutazioni. Qui sviluppiamo un metodo privo di virus per superare queste sfide. Usiamo questo sistema per trasfettare le cellule C2C12 con il dominio motorio della catena pesante della miosina cardiaca umana. Dopo aver ottimizzato le condizioni di trasfezione cellulare, coltivazione e raccolta, abbiamo caratterizzato funzionalmente la proteina espressa, co-purificata con catene leggere essenziali e regolatrici murine. La velocità di scorrimento (1,5–1,7 µm/s; 25 °C) nel test di motilità in vitro, nonché l'attività catalitica attivata dall'actina massima (kcat; 8–9 s−1) e la concentrazione di actina per metà dell'attività massima (KATPasi; 70 –80 µM) erano simili a quelli trovati in precedenza utilizzando l’infezione basata su virus. I risultati dovrebbero consentire la selezione di nuovi tipi di studi, ad esempio lo screening di un'ampia gamma di mutazioni, per un'ulteriore caratterizzazione.

Le miosine sono motori molecolari che sviluppano forza e movimento interagendo con i filamenti di actina in un processo ciclico guidato dal ricambio di ATP. Questo processo è la base per una serie di importanti funzioni, come la contrazione muscolare, la motilità/sviluppo della forza delle cellule non muscolari, il trasporto del carico intracellulare e la segnalazione cellulare1. Recentemente sono state identificate fino a 79 classi2 nella superfamiglia della miosina. Tutti sono costruiti attorno a una catena pesante della miosina (MHC; ~ 90–250 kD) con un sito di legame per l'actina, un sito catalitico per l'ATPasi e altri elementi importanti per la funzione motoria, nonché per la formazione di filamenti e il legame del carico. Inoltre, a ciascuna delle catene pesanti sono attaccate catene leggere, con ruoli stabilizzanti, modulatori e regolatori. Per approfondimenti sui meccanismi di base della funzione motoria della miosina, ma anche per studi dettagliati sulle mutazioni che causano malattie, è importante essere in grado di esprimere e purificare tutti i componenti proteici menzionati.

Il sistema più utilizzato per esprimere e purificare le proteine ​​si basa su E. coli come ospite di espressione, con conseguenti rese di purificazione elevate (se il prodotto di espressione è solubile) nonché efficienza in termini di manodopera e costi3. Tuttavia, il sistema procariotico non dispone di un meccanismo cellulare completo per assistere l'appropriato ripiegamento e la modificazione post-traduzionale delle proteine ​​eucariotiche. Mentre l'espressione e la purificazione delle catene leggere funzionali della miosina è possibile utilizzando E. coli, le catene pesanti della miosina (MHC) non possono essere prodotte in forma funzionale utilizzando questo sistema4. Pertanto, sono stati sviluppati una varietà di sistemi di espressione e purificazione eucariotici basati su Dictyostelium5,6,7, Drosophila melanogaster8, cellule di insetti9,10,11,12,13,14 e cellule di mammifero15,16. Sebbene questi sistemi funzionino bene per la produzione di una varietà di classi MHC, hanno avuto un successo limitato con le miosine dei muscoli striati dei vertebrati17,18,19, probabilmente a causa dell'incapacità di includere tutto il meccanismo di ripiegamento proteico delle cellule muscolari. Sebbene numerosi articoli abbiano identificato l'UNC-45 come chaperone coinvolto nel ripiegamento della miosina e nell'assemblaggio del sarcomero20,21,22,23,24, sembrano esserci altri fattori coinvolti, come Hsp70/Hsp9025 e chaperonin26. In linea con questo punto di vista, Winkelmann e colleghi hanno presentato prove del fatto che il ripiegamento appropriato delle miosine dei muscoli striati in una forma completamente funzionale avviene solo in un ambiente differenziato simile ai muscoli, cioè nei miotubi muscolari27,28,29. Sulla base di questa idea, i mioblasti C2C12 di topo che si differenziano in miotubi sono stati introdotti come linea cellulare ospite di espressione di scelta27. I mioblasti sono stati trasfettati con plasmidi che trasportano l'MHC del muscolo scheletrico embrionale di pollo sotto un promotore, che garantisce che l'espressione dell'MHC inizi solo dopo la differenziazione in miotubi. La resa di purificazione è stata sufficiente per valutare la funzione della miosina in base all'attività dell'ATPasi attivata dall'actina. La generazione di linee cellulari stabili27 in questa prima versione del sistema di espressione e purificazione basato su C2C12 ("sistema basato su C2C12" da qui) offre rese di purificazione relativamente elevate con un flusso di lavoro efficiente in termini di tempo e costi che elimina i cicli di trasfezione. Tuttavia, lo sviluppo stabile della linea cellulare può richiedere fino a 12 mesi30 e non sarebbe l'approccio migliore per esaminare diversi costrutti diversi (ad esempio mutazioni puntiformi) di una particolare miosina. Al contrario, l’espressione transitoria offre il vantaggio di tempi di sviluppo brevi e di un rapido turnover30. Pertanto, il sistema basato su C2C12 è stato successivamente modificato utilizzando l'espressione transitoria di adenovirus per introdurre e studiare l'impatto delle mutazioni puntiformi della miosina associate alle cardiomiopatie ipertrofiche31. Lo stesso sistema è stato ulteriormente ottimizzato da Resnicow et al.32 per consentire la produzione di quantità sufficienti di MHC per l'analisi cinetica transitoria delle isoforme ricombinanti della miosina umana scheletrica e cardiaca33,34,35. Da notare che in questi studi sono state raggiunte attività ATPasi considerevolmente più elevate sia per la miosina β-cardiaca wild type (WT) che per quella mutante rispetto a un precedente rapporto19 in cui i mutanti della miosina β-cardiaca umana erano espressi e purificati da cellule di insetti. Attualmente, l'infezione basata su adenovirus dei miotubi C2C12 consente la produzione di quantità sufficienti di miosine muscolari striate adeguatamente piegate e funzionali (costrutti simili a S1 e HMM) per studi funzionali critici, tra gli altri, test di motilità in vitro e cinetica di soluzioni biochimiche transitorie34,36.